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摘要：目的 优化乌梢蛇醇溶蛋白质提取工艺，并对其进行指纹图谱表征。方法 在单因素试验基础上，以料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间为影响因素，提取率为评价指标，响应面法优化提取工艺，再进行FTIR、SDS-PAGE分析。结果 最佳条件为料液比1:43.15，乙醇体积分数46.35%，提取温度37.53℃，提取时间250分钟，提取率为0.4072%。醇溶蛋白质在4000～400 cm⁻¹波数范围内有10个吸收峰，并且其种类丰富，分子量在11.19～158.10 kDa范围内，其中26.48、19.67 kDa为指纹图谱主峰。结论 本实验可为乌梢蛇开发利用及分析鉴定提供依据。
作者：谢超、宋美营、王巧宇、张林松、刘莹、曹云飞、闻崇炜
单位：1. 镇江市食品药品监督检验中心，江苏镇江 2120502. 江苏大学药学院，江苏镇江 212013
关键词：乌梢蛇；醇溶蛋白质；提取工艺；指纹图谱；响应面法；FTIR；SDS-PAGE
引言：乌梢蛇首载于《雷公炮炙论》，为游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades (Cantor)的干燥体，具有祛风、通络、止痉功效，临床上用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼歪斜等症状的治疗。同时，它还是药食同源的中药材之一，可用作祛风湿、温肾阳的食材，或泡制药酒的原料。由于乌梢蛇需求量逐年增加，同时其栖息地被破坏且遭到大量捕杀，导致目前野生资源严重紧缺，市场上混伪品较多。研究表明，乌梢蛇含有丰富的Na、Zn、Sr等微量元素，二十二碳六烯酸等不饱和脂肪酸，核苷、brachystemidines A等小分子化合物，但其专属性均不高，难以进行功效及鉴定研究，同时也存在大量蛋白质，但其结构复杂，提取困难，尚缺乏其药理活性、专属性的系统研究。因此，本实验优化乌梢蛇醇溶蛋白质提取工艺，并建立其指纹图谱，以期为该药材在资源开发利用、分子鉴定方面的进一步研究提供依据。
乌梢蛇首载于《雷公炮炙论》,初名“蕲州乌 蛇”“乌蛇”,《本草纲目》最终命名“乌梢蛇” [1⁃3], 为游蛇科动物乌梢蛇Zaocysdhumnades(Cantor)的 干燥体,其味甘,性平,归肝经,具有祛风､通络､ 止痉功效,临床上用于风湿顽痹､麻木拘挛､中风 口眼歪斜等症状的治疗[4]｡同时,它还是药食同源 的中药材之一,可用作祛风湿､温肾阳的食材,或 泡制乌蛇酒､三蛇酒等药酒的原料[5⁃6]｡
1 材料
由于乌梢蛇需求量逐年增加,同时其栖息地被 破坏且遭到大量捕杀,导致目前野生资源严重紧 缺,市场上混伪品较多[7⁃8]｡研究表明,乌梢蛇含 有丰富的Na､Zn､Sr等微量元素,二十二碳六烯 酸等不饱和脂肪酸,核苷､brachystemidinesA等小 分子化合物,但其专属性均不高,难以进行功效及 鉴定研究[9⁃11],同时也存在大量蛋白质,但其结构 复杂,提取困难,尚缺乏其药理活性､专属性的系 统研究｡因此,本实验优化乌梢蛇醇溶蛋白质提取 工艺,并建立其指纹图谱,以期为该药材在资源开 发利用､分子鉴定方面的进一步研究提供依据｡
2 方法
2、1 蛋白质提取及定量 乌梢蛇研磨粉碎后过70 目筛,精密称取适量,加预设体积分数的乙醇,以 预设温度振荡提取一定时间,12000r/min离心10 min,收集上清,采用Bradford法测定蛋白质含量, 以牛血清蛋白(BSA)为对照品,595nm波长处 吸光度为纵坐标(A),蛋白质质量浓度为横坐标 ((X)) 进行回归得方程为 (A=8 X+0.0072) ( (R^{2}=) 09992)｡再取蛋白质200μL,分别置于A､B管中,A管中加入20μL三氯乙酸静置30min, 13000r/min离心10min去除沉淀,而B管不作任 何处理,在595nm波长处测定吸光度,计算蛋白 质提取率, (公式为提取率 =\frac{(m_{B}-m_{A})}{m} ×100 \%) ,其 中 (m_{A}) 为A管中蛋白质含量, (m_{B}) 为管中蛋白质 含量, m 为乌梢蛇粉末质量。
2、2 单因素试验
2、2、1 料液比 固定提取时间200min,提取温度 40℃,乙醇体积分数40%,料液比分别设定为1∶ 10､1∶20､1∶30､1∶40､1∶50､1∶60,平行 3次｡
2、2、2 乙醇体积分数 固定料液比1∶40,提取 时间200min,提取温度40℃,乙醇体积分数分别 设定为20%､30%､40%､50%､60%､70%,平 行3次｡
2、2、3 提取温度 固定料液比1∶40,提取时间 200min,乙醇体积分数40%,提取温度分别设定 为20､30､40､50､60､70℃,平行3次｡
2、2、4 提取时间 固定料液比1∶40,乙醇体积 分数40%,提取温度40℃,提取时间分别设定为 50､100､150､200､250､300､350min,平行 3次｡
2、3 响应面法 在单因素试验基础上,以料液比 (A)､提取时间(B)､乙醇体积分数(C)､提取 温度 ((D)) 为影响因素提取率Y为评价指 标,采用DesignExpert806软件设计四因素三水 平试验,因素水平见表1｡
表1 响应面法因素水平 Tab1 Factorsandlevelsforresponsesurfacemethod
| $ 因素 $ | $ 水平 $ | ||
|---|---|---|---|
| $-1$ | $ o $ | $1$ | |
| A 料液比 | 1:20 | 1:30 | 1:40 |
| $B$ 乙醇体积分数 $/ %$ | $30$ | $40$ | $50$ |
| $C$ 提取温度 $/^{\circ} C$ | 30. | $40$ | $50$ |
| $D$ 提取时间 $/ min$ | 150 | 200 | 250 |
2、4 傅立叶变换红外光谱(FTIR)检测 样品经 冷冻干燥后加入KBr混匀,研磨压片,置于红外 光谱仪中在 (4000 ~ 400 ~cm^{-1}) 波数范围内检测。
2、5 十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃ PAGE)检测 样品加入TCA至其终浓度为10%, 混匀后室温静置05h,12000r/min离心10min, 弃上清,沉淀中加入等体积丙酮,室温静置05h, 12000r/min离心10min,弃上清,沉淀中加入适 量裂解液(含7mol/L尿素､2mol/L硫脲)处理6h,再加入等量上样缓冲液[含200mmol/LTris⁃ CI ((pH=6.8)) 、80g/L SDS、4g/L溴酚蓝、40% 甘油､40g/L巯基乙醇],沸水浴15min,按常规 方法配制聚丙烯酰胺凝胶后电泳,待溴酚蓝前沿至 凝胶底部时停止,剥取凝胶,进行染色和脱色｡ 26 数据处理 采用凝胶成像仪采集凝胶图像, QuantityOne软件进行分析,根据条带迁移率计算 蛋白质分子量,条带灰度值计算蛋白质含量,公式 [为含量 =\frac{ 样品条带灰度值 }{ 泳道总条带灰度值 } × 100 \% 。]
3 结果
3、1 单因素试验
3、1、1 料液比 由图1可知,随着料液比增加提 取率升高,超过1∶40后趋稳,故确定最佳料液比 为1∶40｡
图1 料液比对提取率的影响 Fig1 Effectofsolid⁃liquidratioonextractionrate
3、1、2 乙醇体积分数 由图2可知,随着乙醇体 积分数增加提取率升高,但超过40%后反而降低, 故确定最佳乙醇体积分数为40%｡
图2 乙醇体积分数对提取率的影响 Fig2 Effectofethanolconcentrationonextractionrate
3、1、3 提取温度 由图3可知,随着提取温度增 加提取率升高,但超过40℃后反而降低,故确定 最佳提取温度为40℃｡
3、1、4 提取时间 由图4可知,随着提取时间延 长提取率升高,超过200min后趋稳,故确定最佳提取时间为200min｡
图3 提取温度对提取率的影响 Fig3 Effectofextractiontemperatureonextractionrate
图4 提取时间对提取率的影响 Fig4 Effectofextractiontimeonextractionrate
3.2响应面法二次回归方程为 (Y=0.39+) 00075A+0022B+0013C+0005681D-0017AB+ (0.0075 A C+0.027 A D-0.013 B C+0.018 B D-0.013) (C D-0.035 A^{2}-0.030 B^{2}-0.012 C^{2}-0.00466 D^{2}) , 结果见表2,方差分析见表3｡由此可知,模型 (P<0.01) 具有高度显著性失拟项 (P>0.05) ,表明 模型可用于分析预测因素 B 、 c 、 (A^{2}) 、 (B^{2}) 、 (A B) 、 (A D) 、 (B D) 有显著或极显著影响( (P<0.05) , (P<) (0.01) ,其他因素无显著影响 (( P>0.05)) 。
响应面分析见图 (5 。) 最终确定最优工艺为料 液比1∶4315,乙醇体积分数4635%,提取温度 3753℃,提取时间250min,提取率为04072%｡ 33 验证试验 按“32” 项下优化工艺进行3 批验证试验,测得提取率为0403%,与预测值 04072%接近(相对误差在±1%以内),表明该工 艺准确可行,具有实际指导意义｡
3、4 指纹图谱表征
3、4、1 FTIR 按“24” 项下方法进行分析,结 果见图 (6 。) 由此可知样品在 (4000 ~ 400 ~cm^{-1}) 波数 范围内共有个吸收峰其中 (3588.88 ~cm^{-1}) 为0H、N-H伸缩振动峰, (2923.90 ~cm^{-1}) 为甲基亚甲基C-H伸缩振动峰, (1612.80 ~cm^{-1}) 为双键伸缩振 动峰,1450.36、 (1228.95 ~cm^{-1}) 为面内弯曲振 动吸收峰, (833. 82 ~cm^{-1}) 为面外弯曲振动吸 收峰｡
表2 响应面法设计与结果
| 试验号 | A | B | C | D | Y 提取率/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | -1 | 0 | 0 | -1 | 0.36 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.39 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.40 |
| 4 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0.38 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.39 |
| 6 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0.40 |
| 7 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0.39 |
| 8 | -1 | 0 | 0 | 1 | 0.32 |
| 9 | 0 | 0 | -1 | -1 | 0.35 |
| 10 | 0 | -1 | -1 | 0 | 0.30 |
| 11 | 1 | -1 | 0 | 0 | 0.33 |
| 12 | -1 | 0 | -1 | 0 | 0.33 |
| 13 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0.37 |
| 14 | 0 | -1 | 0 | 1 | 0.32 |
| 15 | 1 | 0 | -1 | 0 | 0.33 |
| 16 | -1 | 1 | 0 | 0 | 0.36 |
| 17 | -1 | -1 | 1 | 0 | 0.33 |
| 18 | 0 | 1 | 0 | -1 | 0.35 |
| 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.39 |
| 20 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.36 |
| 21 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0.34 |
| 22 | 0 | -1 | 1 | -1 | 0.39 |
| 23 | 0 | -1 | 0 | -1 | 0.32 |
| 24 | 1 | 0 | 0 | -1 | 0.32 |
| 25 | -1 | 0 | 0 | 0 | 0.28 |
| 26 | 0 | 0 | -1 | 1 | 0.37 |
| 27 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0.34 |
| 28 | 0 | 1 | -1 | 0 | 0.36 |
| 29 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.38 |
表3 方差分析结果
| 来源 | 离均差平方和 | 自由度 | 均方 | F 值 | P 值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 模型 | 0.02670 | 14 | 0.001907 | 15.19669 | <0.0001 |
| A | 0.00068 | 1 | 0.000675 | 5.378943 | 0.0360 |
| B | 0.00622 | 1 | 0.006215 | 49.52957 | <0.0001 |
| C | 0.00183 | 1 | 0.001829 | 14.57629 | 0.0019 |
| D | 0.00037 | 1 | 0.000369 | 2.939155 | 0.1085 |
| AB | 0.00123 | 1 | 0.001225 | 9.761785 | 0.0075 |
| AC | 0.00023 | 1 | 0.000225 | 1.792981 | 0.2019 |
| AD | 0.00303 | 1 | 0.003025 | 24.10563 | 0.0002 |
| BC | 0.00070 | 1 | 0.000705 | 5.617156 | 0.0327 |
| BD | 0.00137 | 1 | 0.001369 | 10.9116 | 0.0052 |
| CD | 0.00058 | 1 | 0.000584 | 4.650962 | 0.0489 |
| A² | 0.00776 | 1 | 0.007761 | 61.84328 | <0.0001 |
| B² | 0.00565 | 1 | 0.005645 | 44.98427 | <0.0001 |
| C² | 0.00096 | 1 | 0.000958 | 7.636417 | 0.0152 |
| D² | 0.00014 | 1 | 0.000141 | 1.120943 | 0.3076 |
| 残差 | 0.00176 | 14 | 0.000125 | — | — |
| 失拟项 | 0.00156 | 10 | 0.000156 | 3.113702 | 0.1425 |
| 纯误差 | 0.00020 | 4 | 0.00005 | — | — |
| 总和 | 0.02846 | 28 | — | — | — |
注：R² = 0.9383, R²adj = 0.8765。
3、4、2 SDS⁃PAGE 按“32” 项下优化工艺,分 别提取江西､江苏､黑龙江产乌梢蛇醇溶蛋白质后进行分析,结果见图7｡由此可知,3个产地药材 均含有种类丰富的醇溶蛋白质,其SDS⁃PAGE指纹 图谱具有高度相似性;分子量介于1119~158、10kDa范围内,其中高分子量(55kDa以上)占比 22、56%,中分子量(15~55kDa)占比6573%, 低分子量(低于15kDa)占比11、71%,26、48､19、67kDa条带为其特征性主峰｡
注:a~f分别为乙醇体积分数与料液比､提取时间与料液比,提取温度为料液比､提取温度与乙醇体积分数､提取时间与乙醇 体积分数提取时间与提取温度交互作用 (A ~ D) 分别为料液比乙醇体积分数提取温度提取时间
注:1~3分别为江西､江苏､黑龙江产乌梢蛇,M为蛋白质分 子量标准品｡
4 讨论与结论
乌梢蛇药用､食用价值均较高,但其物质基础 不明｡前期有采用响应面法优化老鹳草槲皮素､补 骨脂总黄酮､金蝉花多糖､紫米糠蛋白质､燕窝唾 液酸提取工艺的报道[12⁃16],而本实验也以其优化 乌梢蛇醇溶蛋白质提取工艺,为开展该药材功效物 质基础研究及相关资源开发利用创造了条件｡
目前,乌梢蛇野生资源破坏情况严重,而家养 尚难以形成规模,导致供应较为紧张,市场上混伪 品众多,杨吉玉等[17⁃18]提出了微性状鉴别研究方 法,李峰等[19]建立了高效毛细管电泳指纹图谱用 于质量评价,沈海英等[20⁃22]报道了PCR鉴定方法｡ 本实验发现,乌梢蛇醇溶蛋白质种类多样,丰度均 衡,SDS⁃PAGE分析时可避免条带相互覆盖,能建 立稳定清晰､信息丰富的指纹图谱,从而为该药材分子鉴定及质量控制提供了新的思路与依据。
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乌梢蛇醇溶蛋白质提取工艺优化及其指纹图谱表征：https://www.python.hn.cn/4263.html
